pyrrolizidine alkaloiden

Dit artikel is vertaald uit het Engels door Gonnie van Elteren, zij is fytotherapeut en geen scheikundige of celbioloog, het kan dus zijn dat er in de vertaling fouten zijn geslopen. (mocht u deze tegenkomen, reageer dan vooral!). De oorspronkelijk schrijfster is Alison Denham, een lid van het National Institute of Medical Herbalists. Zij is medeoprichter van het Silphion Project, wiens doel het is om wilde planten te beschermen die worden bedreigd door verzamelaars die de planten medicinaal willen inzetten. Ze praktiseert in Leeds.

Inleiding
Pyrrolizidine alkaloïden, die in de rest van dit artikel aangeduid gaan worden met de afkorting PA’s, komen hoofdzakelijk voor in de Ruwbladigenfamilie (Boraginaceae) en de Composietenfamilie (Asteraceae). Deze PA’s bevatten een onverzadigde ringstructuur die heeft bewezen schade te kunnen aanrichten aan leverweefsel. Deze schade lijkt onomkeerbaar en soms zelfs fataal. PA’s werden in eerste instantie geïsoleerd door onderzoekers die een aantal sterfgevallen onder vee onderzochten, PA’s bleken de oorzaak te zijn van het overlijden van dit vee. Later bleek dat ze ook de oorzaak waren van vergiftigingsgevallen onder mensen die voedselgewassen hadden geconsumeerd, die vervuild waren met PA’s bevattende onkruiden. Vergiftigingsverschijnselen veroorzaakt door fytotherapeutische medicijnen kwamen vooral voort uit gebruik van Senecio en Crotalaria spp., maar er zijn ook gevallen bekend van vergiftiging door planten als Symphytum spp, al zijn die zeer zeldzaam, toch mogen ze niet worden genegeerd.¹

Dit artikel is een poging om herboristen te informeren over de literatuur en de studies, die tot dusverre zijn verschenen over het onderwerp van PA-vergiftiging. Praktisch al het onderzoek is verricht op dieren, de oorspronkelijke schrijfster van dit artikel legt de nadruk op het feit dat ze verwijzingen naar onderzoek op dieren tot een minimum heeft beperkt.

Zorgen over de toxiciteit van PA’s heeft geleidt, tot een beperking van het aantal producten waarin Symphytum is verwerkt, in de VS, Australië en de EU⁷. De uitkomst van sommige onderzoeken nemen een ‘a worst case-scenario’ en stellen voor om alle kruiden die PA’s bevatten te verbieden of te beperken in beschikbaarheid.

Dit artikel is een poging om alle factoren die een rol spelen, in het verantwoordelijk voorschrijven van PA’s bevattende planten beschikbaar te maken voor herboristen, met name gericht op Symphytum spp.

Definitie
Meer dan 160 pyrrolizidine alkaloïden zijn tot dusverre geïsoleerd. Ze behoren allemaal tot de esters en variëren substantieel in toxiciteit, afhankelijk van hun structuur. Ze bestaan uit een necinebase en organische zuren. De basis is een amino-alcohool bestaande uit twee 5-koolstofringen met een stikstofatoom op positie 4, een hydroxymethylgroep op 9 en een hydroxylgroep op 7. Hepatotoxische PA’s hebben allemaal een onverzadigde 1,2- dubbele binding in de pyrrolizidinering. Verzadigde PA’s die veel voorkomen in o.a. in Echinacea zijn niet hepatotoxisch.⁹ De carboxylische zuren, genaamd necinezuren, variëren zowel in lengte, als in het aantal vertakkingen.

Absorptie en hepatische detoxificatie
PA’s verschijnen in planten als vrije basen of als nitrogenoxiden (N-oxiden). Na consumptie worden PA’s, of afgescheiden via de darmen, of geabsorbeerd. De N-oxiden zijn wateroplosbaar en worden om deze reden waarschijnlijk onveranderd uitgescheiden, maar ze worden ook geabsorbeerd, mogelijk na een stofwisselingsproces door darmbacteriën. Absorptie van N-Oxiden is meer geleidelijk dan die van vrije basen.

Onderzoek naar de absorptie van PA’s, is moeilijk omdat deze onmiddellijk worden gemetaboliseerd in de lever. Echter, experimenten met het voederen van PA’s bevattende stoffen aan dieren, tonen aan dat PA’s geïsoleerd van Symphytum spp. en daarna gegeven aan ratten, worden opgenomen door de darmen.¹⁰

Na absorptie bereiken PA’s de lever. Detoxificatie van lichaamsvreemde bestanddelen in de hepatocyte (levercellen) hangt af of het bestanddeel goed wateroplosbaar is en dus makkelijk kan worden uitgescheiden door de nieren. Iedere soort bestanddeel wordt gedetoxificeerd, vaak in stadia, door de meest toereikende chemische reacties beschikbaar. Dit proces kan falen als de hoeveelheid van de ingenomen giftige stof, de mogelijke detoxificatiereactie overtreft. De chemische reacties die beschikbaar zijn in de levercellen, variëren in efficiëntie voor iedere gifstof en ook nog eens per individu. ¹¹

Detoxificatie van PA’s door levercellen gebeurt door middel van hydrolyse door de cholinesterasen van een ester-binding. Alleen de ester is toxisch, de bestanddelen necinebasen en de organische zuren zijn dat niet.

Di-esters zijn aanmerkelijk giftiger dan mono-esters, en de meeste macrocyclische di-esters zijn weer giftiger dan noncyclische di-esters. Het is niet bekend hoe goed de manier van ontgiftiging via de lever, werkt op deze stoffen, maar wel duidelijk is dat de verschillen in structuur en stereochemie van PA’s, het proces van hydrolyse bepalen en daarmee de giftigheid van de verschillende PA’s. ¹²

PA’s die niet worden gehydrolyseerd, worden gemetaboliseerd door microsomale enzymen die zich bevinden op het gladde endoplasmische reticulum van de levercel, dit resulteert in of N-oxideformatie of dehydrogenatie. N-oxiden zijn wateroplosbaar en worden uitgescheiden in de urine en deze reactie is dus een detoxificatie. Dehydrogenatie resulteert in de vorming van zeer reactieve electrophilische pyrrolen (dehydroalkaloiden).¹³ De snelheid van deze vorming is afhankelijk van het type ester. Onderzoek naar de chemische analogieën van PA’s laten zien, dat de noncyclische di-esters ertoe neigen om te worden geoxidiseerd tot N-oxiden door sterische verhindering op C8, door de necische zuren. Men denkt dat dehydrogenatie van de necinebases op C8 gebeurt. De necische zuren in macrocyclische di-esters worden door de ringstructuur weggehouden van C8. de relatieve snelheid van de vorming van pyrrolen is het hoogst in de onverzadigde 12- carbon macrocyclische di-esters.^14,15 Retronecine di-esters geven 15 maal meer pyrrolen dan mono-esters. 12-takkige onverzadigde macrocyclische di-esters zoals senecionine zijn het meest resistent tegen detoxificatie door middel van hydrolysis of door oxidatie. Lipophiliciteit en wateroplosbaarheid zijn ook van invloed op de snelheid en het type reactie.

Manieren van PA oxidatie en reductie
De pyrrool is de toxine, als deze niet gedeactiveerd wordt door middel van conjugatie met cytoplasmische glutathioon, vormt deze covalente verbindingen met de dichtstbijzijnde plek in de levercel, meestal met thiol (zwavel) groepen en dergelijke op DNA en RNA. Pyrroolalkylatie veroorzaakt proteïne-proteïne kruisverbindingen, DNA-proteïne kruisverbindingen en DNA-DNA kruisverbindingen. De pyrroolverbindingen op C7 met een bestanddeel, en op C9 met een ander bestanddeel. In een aantal laboratoriumonderzoeken is aangetoond dat dit de oorzaak is van schade aan de levercellen en dus ook aan het leverweefsel.

In vitro-onderzoek op de epitheliale niercellen van runderen liet zien, dat macrocyclische di-esters, vooral die met een onverzadigde carboxylische zuurring de meest krachtige kruisverbindingen aangaan. ¹⁶ De reactie is afhankelijk van de dosering en een opmerkelijk deel van de verbindingen zijn met proteinen, zowel nucleair en cytoplasmisch. Eerder onderzoek op epitheliale niercellen van runderen liet zien dat de open di-esters minder kruisverbindingen aangaan zonder nadelige gevolgen bij een concentratie van 50 mM.¹⁵

Detoxificatie gebeurt wanneer de electrophilische pyrrool samengaat in het hepatocyte cytoplasma met de tripeptide glutathioon. Dit is de Fase II detoxificatiereactie die belangrijk is in de detoxificatie van vele stoffen.¹⁷ Het resulterende oplosbare thioolpyrrool wordt uitgescheiden via de gal of de urine. Dit samengaan wordt gekatalyseerd door cytoplasmische glutathioon S-transferasen. Interindividuele variaties zijn er in de concentratie van hepatocyte glutathioon en in de relatieve concentratie van individuele glutathioon S-transferasen.¹⁸ Glutathioon is een tripeptide inclusief cysteine, een zwavelbevattende aminozuur gevormd uit de essentiële aminozuur methionine.

Microsomale oxygenatie is gekatalyseerd door het cytochrome P-450 mono-oxygenase systeem wat betrokken is bij talloze detoxificatie reacties.¹⁹ In vitro is aangetoond, met menselijk leverweefsel dat senecionine gemetaboliseerd wordt door cytochroom P450 IIIA4 (CYP3A4) tot de pyrrole dehydrosenecionine (DHS) en senecionine N-oxide.20. Van de zeven monsters in het experiment, waren er drie heel erg actief en vier hadden een lage activiteit richting senecionine. De resulterende variatie in de snelheid van formatie van DHS was 30-voudig en dat van senecionine N-oxide 25-voudig. Deze interindividuele verschillen zijn belangrijk, deze variaties in pyrroolproductie kunnen de oorzaak zijn van de verzadiging tijdens de glutathionedetoxificatie-omzetting.

Leverschade
Microsomale enzymen zijn geconcentreerd in centrilobulaire hepatocyten. Als genoeg pyrrolen zich binden met DNA, RNA of nucleaire proteinen, kunnen de levercellen niet langer functioneren. Als pyrrolen zich binden met cytoplasmische proteinen die verantwoordelijk zijn voor de samenhang van de cel, kan er blaasjesvorming optreden op het celmembraan, gevolgd door afbraak van de cel. Als dit boven een bepaalde snelheid gaat is het resultaat centrilobulaire hepatocyte necrosis. Dit is de belangrijkste bevinding in het onderzoek naar pyrrolizidine alkaloïde hepatotoxiciditeit en is de eerste stap naar beschadiging van het leverweefsel. Yeong et al demonstreerde deze vroege mutaties in ratten die gevoerd werden met PAs geisoleerd van Symphytum x uplandicum. Ze ontdekten doseringsafhankelijk verlies van perivenulaire hepatocyten, het lekken van rode bloedcellen in de Ruimten van Disse (tussen hepatocyte en sinusoiden), sinusoidale congestie en een verdikking van de terminale hepatische venulen.²¹

Als er sprake is van een serieuze weefselbeschadiging, dan is het resultaat hepatische veno-occlusieve ziekte (VOD). Dit is een subgroep van het Budd-Chiarisyndroom, waar een aantal condities onder vallen, die veroorzaakt worden door een obstructie van de doorstroming van de hepatische vene. VOD wordt gekarakteriseerd door hepatomegalie en refractorische ascites. Meestal is er sprake van een verwijding van de centrale vene, sinusoidale congestie, centrilobulaire necrosis, occlusie van de kleine venen door fibrine, afkomstig van de afbraak van cellen, subintimaal weefseloedeem en een verdikking van de kleinere hepatische venulen.^22,23

Vergiftigingsgevallen bij dieren

Onderzoek naar PA's werd ontwikkeld, omdat wetenschappers op zoek waren naar een verklaring voor het plotselinge sterven van vee. Vee wordt regelmatig slachtoffer van vergiftiging met PA’s bevattende planten, vooral Senecio en Crotalaria spp. Maar soms ook Echium, Heliotropium en Cynoglossum. Dit verschijnsel komt wereldwijd voor en kan een probleem zijn. Een vergiftiging met ‘Seneciohepatitis' bij koeien werd het eerst gemeld in Iowa in 1884. Andere gevallen handelen om paarden, kippen, kalkoenen en varkens. Schapen, geiten en konijnen lijken meer restistent. Dit wordt toegeschreven aan een proces genaamd ruminale microbiale detoxificatie, dat schapen beschermt tegen de absorptie van PAs27 in particulaire non-cyclische di-esters. Cavia’s en hamsters zijn heel erg resistent.

Vergiftigingsgevallen bij mensen
Een rapport aan de Zuid-Afrikaanse regering in 1918 bracht consumptie van tarwebloem, dat was vervuildmet Senecio spp in verband met VOD. Grote uitbraken van PA-vergiftiging door vervuiling van granen met zaden van planten als Heliotropium spp. zijn voorgekomen in Afghanistan, Oezbekistan en Tadzjikistan. In Tadzjikistan is het probleem nu uitgeroeid door een groot voorlichtingsprogramma van de overheid. De uitbraak in 1992, vond plaats gedurende een periode van gevechten wat de Farkjarregio isoleerde en de oogst met twee maanden vertraagde²⁹.

Tegen maart 1993, werden er 3906 vergiftigingsgevallen gemeld. 4% van de bevolking van de 10 collectieve boerderijen was aangedaan, op een boerderij was dat zelfs 23%. De groep die het zwaarst getroffen was, was de groep tussen de 1-14 (5.4%), het hoogste aantal sterfgevallen kwam voor in de groep van mensen van over de 50 jaar. De vervuilende zaden waren waarschijnlijk afkomstig van Heliotropium popovii subsp. gillianum die een PA genaamd heliotrine bevat³⁰. Een uitbraak kwam ook voor in 1974 in een afgeleven deel van noordwest Afghanistan, volgend op twee jaren droogte van 1970 tot 1972. De bevolking at vooral veel tarwebrood en wat vlees. Het onkruid Heliotroop kon goed tegen de droogte en vervuilde de oogst.

7200 mensen van de 35.000 in de streek werden onderzocht in 1975 en van hen had 22% tekenen van een leveraandoening, van deze 22% waren er 46% onder de 14 jaar. 21 mensen werden naar Kaboel overgebracht voor verdere behandeling en autopsies van hun lever lieten de typische verschijnselen van VOD zien. ^31,32

Huidige zorgen van wetenschappers
De zorgen van wetenschappers over het gebruik van PA’s bevattende planten, is dat sub-klinische schade kan leiden tot aanhoudende centrilobulaire fibrosis, wat resulteert in cirrose.³³ De bevindingen van Stuart & Bras zijn in dit opzicht van belang³⁴. Zij vonden door leverbiopsie dat er sprake was van een geheel genezen lever bij sommige acute gevallen, met name onder kinderen tussen de 2 en de 15 jaar oud. In contrast hiermee waren er gevallen waarbij, "wanneer de veneuze occlusie zich herhaald, of zich niet volledig omkeert er sprake is van een residuale ineenstorting van het centrilobulaire reticuline framewerk, dat snel wordt gevolgd door proliferatie van fibrose weefsel", op deze manier ontwikkeld zich een non-portale cirrose."³⁴ Als de fibrosis voortschrijdt, geven de collaterale vaten een soort kortsluiting met het non-geoccludeerde deel van de hepatische veneuze stam, waardoor er in het gebied ischaemia, necrosis en littekenweefsel ontstaat. De aandoening lijkt sprekend op andere vormen van cirrose.

Het tweede gebied van zorg is dat PAs mogelijk carcinogeen kunnen zijn, DNA-kruisverbindingen zijn een van de indicaties in vitro van carcinogeniciteit. Ander onderzoek naar de genotoxiciditeit van PAs is uitgevoerd op Drosophila melanogaster (fruitvlieg). Het onderzoek liet zien dat de open di-esters 7-acetylintermedine en 7-acetyllycopsamine enig genotoxisch effect hadden, maar minder sterk dan de meest krachtige macrocyclische PAs.³⁵

Carcinogeniciteit is een apart gebied van onderzoek dat nog verder verkend moet worden.³⁶ De toxiciditeit van PA’s is inmiddels wel duidelijk aangetoond, maar veel vragen zijn er nog over hun giftigheid in fytotherapeutische bereidingen.

Het voorkomen van PA’s
Meer dan 240 medicinale planten bevatten PA’s, de meest bekende:

Boraginaceae:

- Alkanna tinctoria (L.) Tausch.

- Anchusa officinalis L.

- Borago officinalis L.

- Cynoglossum officinale L.

- Lithospermum officinale L.

- Symphytum spp.

Asteraceae:

- Eupatorium spp

- Petasites spp

- Senecio spp

- Tussilago spp.

In dit artikel zal het verder gaan over Symphytum spp. De ietwat gecompliceerde taxonomie van Symphytum spp. is al in detail uitgewerkt.³⁷ De belangrijkste Euraziatische soorten zijn:

- Symphytum asperrimum Lepech (Stekelige Smeerwortel)

- S. caucasicum Bieb

- S. officinale L. (Gewone Smeerwortel)

- S. tuberosum L

- S. x uplandicum Nyman (Russische of Kaukasische Smeerwortel)

S. officinale groeit in het wild in Groot-Brittannie (en ook in Nederland) op vochtige gronden. Maar veel van de Smeerwortel die wordt geteeld en die langs wegkanten groeit, is meestal S. x uplandicum, een natuurlijk voorkomende hybride tussen S. asperrimum en S. officinale. S. asperrimum werd vanuit Rusland geïntroduceerd in Europa als tuin – en voedselplant voor vee. In de context van de huidige discussie over de giftigheid van deze plant is het interessant om te weten, dat Smeerwortel in Engeland blijkbaar al vanaf de jaren veertig van de 19^de eeuw als veevoer werd gezien.³⁸

Symphytum officinale en S. x uplandicum zijn erg gelijk en hun nakomelingen zijn vruchtbaar.³⁹

De kleur van de bloemen is erg variabel. Bij S. officinale bereikt de calyx (ring van sepalen) de helft van de corolla (bloem), in de S. officinale is deze meer rond dan in S. x uplandicum, wiens calyx slechts tot eenvierde de corolla bereikt. S. officinale is kleiner, minder borstelig en heeft gevleugelde bladribben die ieder blad verbinden aan de bladverbinding daaronder. S. x uplandicum heeft smallere vleugels die de vorige bladverbinding niet bereiken. De zaden van de S. officinale zijn glanzend en bij de S. x uplandicum zijn ze dof.

PA- concentratie
De concentratie van PA’s varieert in verschillende plantenmonsters. Om het totaal aantal procenten van de oplosbare N-oxiden te berekenen worden deze geprecipitateerd en gecombineerd met de vrije basen. Deze worden geïsoleerd door een combinatie van hogedrukvloeistofchromatografie en gasmassa spectra. De technische accuratie is de afgelopen periode sterk toegenomen,^40,41,42 en ik heb mij gehouden aan moderne bronnen. Belangrijke oudere bronnen worden wel genoemd in de referenties.^43,44,45 De metingen zijn verricht op gedroogd plantenmateriaal.

Verschillende auteurs gebruiken die manieren van het meten van de concentratie. Voor referentie, 0.03% = 300 p.p.m = 300 mg/kg 1 kg = 1,000,000 mg.

Symphytum officinale
Roeder citeert concentraties van 200 mg/kg to 1800 mg/kg in gedroogde bladeren van S. officinale.⁵ Awang et al analyseerde 5 monsters en vond 200 tot 2000 mg/kg PA’s in totaal.⁴⁶ Dit laatste cijfer van 2000 mg/kg correspondeert met het cijfer dat wordt gegeven door Roeder voor het blad van de S. x uplandicum en is mogelijk niet van de S. officinale. (dit soort verwisseling van soorten komt vaker voor in het onderzoek naar het PA=gehalte in symphytumspecies)

Mütterlein en Arnold⁴⁷ analyseerde 9 monsters van grote bladeren van de S. officinale en vonden een gemiddelde concentratie van 3 mg/kg. Hun onderzoek bevestigt eerdere bevindingen dat de PA’s zich het sterkst concentreren in de jonge kleine bladeren. Twee monsters van jonge bladeren bevatten 87 mg/kg PA’s in 5 cm lange bladeren verzameld in maart 1991 en 16 mg/kg PA’s in bladeren tot 15 cm lang verzameld in april 1992. deze verandering in concentratie van PA’s in bladeren, is om deze te beschermen tegen insecten en slakken.

Mütterlein & Arnold analyseerde 300 monsters van S. officinale-wortels verzameld op 150 plaatsen in Duitsland en vonden 450 tot 5990 mg/kg PAs, gemiddeld 1700 mg/kg. Roeder citeert van 2500 tot 2900 mg/kg. Awang et al analyseerde 5 monsters die 700 tot 1700 mg/kg PA’s bevatten.

Symphytum x uplandicum en anderen
S. x uplandicum onderscheidt zich van de S. officinale door echimidine te bevatten, die waarschijnlijk de meest toxische PA in Symphytum spp. is^44. S. x uplandicum heeft verder ook aanmerkelijk hogere spiegels van alkaloiden, die duidelijk maken dat het gebruik van S. officinale te prefereren is. In een aantal gevallen bevatten monsters van S. officinale wel echimidine, maar dit is uitzonderlijk.³⁹

S. asperrimum Lepech, bevat tot 1300 mg/kg aan alkaloiden in het blad en tussen de 1400 en 3700 mg/kg in de wortel.

Van S. caucasicum Bieb, bevatte de wortel 4800 mg/kg aan PA’s.⁵ S. asperrimum is de ouder van S. x uplandicum die echimidine bevat. Deze plant heeft ook hoge PA levels en kan beter niet medicinaal worden ingezet.

S. tuberosum L. heeft laten zien dat het 72 mg/kg PA N-oxiden in de bladeren bevat ⁴⁸ en 180 mg/kg in de wortel.⁴⁹ S. tuberosum bevat aanmerkelijk lagere PA-levels dan andere Symphytum spp. En relatief hoge levels aan allantoine, 0.96% in de wortel en 0.98% in de bladeren. (Allantoine is de meest werkzame inhoudsstof van Symphytum spp.). Mogelijk dat dit S. tuberosum L. de meest geschikte soort maakt voor medicinaal gebruik. ⁵⁰

De variatie in PA-concentratie van zowel in het wild verzamelde en commercieel geteelde planten, geeft aan dat het gericht selectief telen van deze plant een manier kan zijn om het gehalte aan PA’s omlaag te krijgen en het gehalte aan allantoine omhoog. Bepaalde variëteiten van de S. x uplandicum, vooral de Bocking-variëteiten van het Henry Doubleday Research Association,³⁸ zijn ontwikkeld om als veevoer en groenbemester te worden ingezet en hetzelfde kan men doen met S. officinale die men makkelijk kan vermeerderen via deling.

De alkaloïden in S. officinale zijn de isomerische mono-esters lycopsamine en intermedine, de isomerische di-esters 7-acetyl lycopsamine en 7-acetyl intermedine, de isomerische di-esters symphytine, symlandine en symviridine, en heel soms, echimidine. Ze zijn allemaal gebaseerd op retronecine.

Identificatie van commerciele monsters van Smeerwortel wordt gehinderd door een gebrek aan goed labelen van de producten. De Canadese regering heeft een onderscheidt gemaakt tussen S. x uplandicum en S. officinale, de eerste mag niet meer verkocht worden, de tweede wel. Onderzoek wees echter uit dat van de 13 monsters er 9 echimidine bevatten, de stof die kenmerkend is voor S. x uplandicum. Van 6 monsters die als S. officinale waren gelabeld bevatten er drie een hoog level aan echimidine wat aangeeft dat het waarschijnlijk ging om monsters van S x uplandicum.⁴⁶

Het Ministry of Agriculture, Fisheries and Food (MAFF) onderzocht het gehalte aan PA’s in 15 commerciele monsters van Symphytum officinale in 1991.⁵¹ Ze brouwden ook een aantal infusen van de plantendelen, er wordt niet verteld over de wijze waarop.

De FDA analyseerde 11 monsters aangekocht in de VS in 1989. De monsters bevatte lage spiegels aan PA’s, twee monsters bevatten helemaal geen PA’s, wat mogelijk aangeeft dat ze helemaal geen smeerwortel bevatten.⁵² De onderzoekers van de FDA bereidde ook een thee door 2 gr plantenmateriaal, 5 minuten in 350 ml water te laten trekken. Het resultaat liet zien dat PA’s zich moeilijk laten afgeven in water. Of dit over blad of wortels gaat is niet duidelijk.

Er is wel consensus over het uitwendig gebruik van Smeerwortel. Deze informatie is afkomstig van 1 onderzoek op ratten waaruit bleek dat op de huid aangebrachte PA N-oxiden niet worden gereduceerd tot vrije PA’s en dat ze dus nauwelijks worden opgenomen door de huid. De excretie van PA N-oxiden in de urine was gedurende 2 dagen, 0.1- 0.4% van de op de huid aangebrachte dosering.⁴⁵

Discussie
Gezien de wijdverbreide consumptie wereldwijd van PA-bevattende kruiden, is het aantal mensen dat VOD ontwikkelden, na het innemen van fytotherapeutische remedies met deze kruiden, zo klein dat ze kunnen worden afgedaan als idiosyncratische reacties. Echter zijn de wetgevende instanties zo drastisch met hun maatregelen, vanwege de het feit dat de toegebrachte schade aan de lever door PA’s sluipend verloopt. Geen klinische indicatie voor abnormaliteiten aan de lever worden aangetoond tot serieuze schade is ontstaan.

Als fytotherapeuten hebben we een plicht tegenover onze patienten om te kijken naar iedere zijde van het argument en zullen we de bewijsvoering van beide zijden moeten evalueren.

Wat voor leidraad geven de bewijzen ons als we deze kruiden wel of niet willen voorschrijven in de praktijk? Om dit te bespreken, keer ik terug naar het begin en bespreek ik de manier van werken van PA’s.

Verschillende PA’s
Verschillende PA’s varieren in gifitigheid vanwege hun verschillen in stereochemie.³⁵ De graad van giftigheid gaat van mono-esters naar open di-esters tot onverzadigde macrocyclische di-esters.¹⁶ Echter sommigen komen erg overeen en zelfs isomerische PA’s varieren aanmerkelijk in toxiditeit. Van de PA’s die gevonden worden in Symphytum spp, zijn alleen echimidine en de isomeren van symphytine vertakt. Van de stereochemie van het tiglische zure deel van symphytine wordt verondersteld dat het hydrolysise verminderd.⁵³ Geen enkel behoort tot de macrocyclische di-esters. Intermedine en lycopsamine zijn mono-esters. De PA’s in Symphytum spp. behoren tot de minder gifitge PA’s.

Dosering
Veel onderzoek over de giftigheid van PA’s is verricht met grote hoeveelheden geïsoleerde PA’s, die werden geïnjecteerd in dieren of door PA-extracten in vitro bij hepatocyten te voegen. Men kan de vraag stellen of de bevindingen bij deze dieren, ook toepasbaar is bij mensen, met betrekking tot de dosering. In ratten is het mechanisme van zowel microsomale activatie en detoxificatie ietwat verschillend bij dat van mensen. ¹⁹

Deze vraag over dosering staat centraal bij iedere discussie over de toxiciteit van PA’s. Er is een enorm verschil tussen de doseringen, die zijn gebruikt tijdens de onderzoeken en de doseringen die gebruikt worden door fytotherapeuten, ook de manieren van toedienen verschillen nogal en bovendien maken fytotherapeuten geen gebruik van geïsoleerde PA’s.

Het onderzoek gedaan op dieren betrof allemaal hoge doseringen. Yeong et al bijvoorbeeld extraheerde in totaal 1 gr. PA’s uit 1.5 kg verse wortels en bladeren van de Symphytum x uplandicum Nyman.¹⁰ Door deze samen te voegen ga je volledig voorbij aan de verschillende PA concentraties in wortels en bladeren. 4 ratten kregen vai hun voer 200 mg/kg van geëxtraheerde PA’s in een enkele dosering, 4 rats kregen drie maal per week, drie weken lang 100 mg/kg (in totaal 900 mg), 4 ratten kregen drie maal per week, drie weken lang 50 mg/kg (in totaal 450 mg) en 2 controleratten in iedere groep, werden gevoerd met een oplossing van 0,1 M hydrochlorisch zuur.

Veel reguliere middelen die in een hoge dosering toxische effecten hebben, worden wereldwijd voorgeschreven in een aanbevolen dosering. Een goed voorbeeld is acetaminophen (Paracetamol) dat in een hoge dosering gelijke hepatoxische effecten kan hebben als PA’s. De metabolisering van Paracetamol in de lever door microsomale enzymen, genereert een reactieve metaboliet die wordt gedetoxificeerd door glutathioneverbindingen. Als dit mechanisme verzadigd is dan bindt de reactieve intermediaat zich met de hepatocyte proteinen.⁵⁴ Er is veel interindividueel verschil, maar doseringen van 10 tot 15 gr zijn gifitg.⁵⁵ Overdoseringen, zowel met opzet als per ongeluk, zijn een veel voorkomende doodsoorzaak. De behandeling hangt af van toediening van Acetylcysteine, binnen 10 tot 12 uur na de vergiftiging. Dit stimuleert glutathioonsynthesis en daarmee de detoxificatie van de reactieve metaboliet. Paracetamol is vrij verkrijgbaar en wordt vaak voorgeschreven aan kinderen. ⁵⁶

Paracetamol staat niet op de lijst om verboden te worden, als vrij verkrijgbaar geneesmiddel. Een gelijk risico/voordeelaspect hangt aan het gebruik van Smeerwortel bij de aanbevolen dosering waar het voordeel opweegt tegen het statistische risico van bijwerkingen. Echter is het zo dat in wetenschappelijk onderzoek waarbij wordt aanbevolen om medicinale planten te verbieden voor de vrije verkoop men over het algemeen hun nut als geneesmiddel minimaliseert.

In een artikel uit 1942 uit het NIMH Journal, wordt Smeerwortel gezien als de meest nuttige plant in de Pharmacopoeia, met name voor spijsverteringsaandoenignen zoals maag – en darmzweren en voor chronische bronchitis en tuberculose, en uitwendig voor wonden, kneuzingen en langzaam helende breuken.

De WHO tekst⁵⁸ heeft een serieuze poging gedaan om dosering in gevallen van PA-vergiftiging te bespreken, maar het gebrek aan gegevens, met name over de betrokken planten, zorgt voor veel dubbelzinnigheid en open eindjes. Het zou in alle gevallen goed zijn om zowel een dagelijkse dosering en een totale dosering te bepalen. ⁵⁹

Wereldwijd zijn er vier gevallen van een PA-vergiftiging waarbij Symphytum spp. zijn betrokken. In twee gevallen gaat het om Amerikaanse vrouwen die Smeerworteltabletten namen. In het eerste geval,⁶⁰ ging het om een 47-jarige vrouw die in 1978 Smeerwortelthee kreeg aanbevolen.

Ze begon met het innemen van tot 10 koppen thee per dag, samen met de inname van grote hoeveelheden Smeerwortelpillen, dit ging meer dan een jaar zo door. In 1982 waren haar serumaminotransferasewaarden meer dan twee keer zo hoog als normaal en begon zij ascites te ontwikkelen. In 1986 werd zij behandeld door een internist, de leverschade kwam overeen met de diagnose van VOD.

In het meest geciteerde geval was er een 49-jarige vrouw die zes capsules Smeerwortelpepsine per dag innam, vier maanden lang. ⁶¹ Daarbij nam ze dagelijks Mu-16 thee, dat ook PA’s bevat, maar wat de onderzoekers over het hoofd zagen, omdat ze alleen de Smeerwortelpepsinecapsules analyseerden.⁶² De PA’s in de Mu-16 thee zouden mogelijk de giftige macrocyclische di-esters zijn geweest. De vrouw kreeg ook de karakteristieke verschijnselen van VOD en wat de oorzaak ook geweest was, ze werd ernstig ziek na een relatief lage doseirng.

De drempel voor weefselbeschadiging

Veel onderdelen van van het onderzoek laten zien dat de reactie op PA’s afhankelijk is van de dosering. ^10,15 In vitro-onderzoek liet zien dat er een drempel is naar weefselbeschadiging. Onder een onbepaald level, waarbij de detoxificatiemechanismen niet overweldigd worden is er geen weefselbeschadiging. Het onderzoek op de epitheliale niercellen van runderen liet meer zien over PA-geinduceerde cytopathie. De resultaten bevestigen weer het belang van het type PA en de dosering van deze PA’s. Cellen die werden blootgesteld aan macrocyclische di-esters bij lagere PA-concentraties begonnen na drie weken hun normale mitosis en bij de hoogste concentratie (300mM) werd de cellulaire morfologie weer na 6 weken normaal. De celgroei werd slechts in geringe mate onderdrukt na blootstelling tot 500mM aan de open di-esters heliosupine en latifoline en helamaal niet na blootstelling aan necinebase retronecine 500 mM.⁶³

Een significant gedeelte van het onderzoek geeft de suggestie dat er een alles of nietsdrempel is voor weefselbeschadiging bij een level dat bereikt kan worden door een dosering of door cumulatieve doseringen gegeven gedurende een bepaalde tijd.

Interindividuele verschillen

De twee beschreven gevallen van vergiftiging toegeschreven aan Smeerwortel lieten al het belang zien van individuele gevoeligheid voor PA-toxiditeit. Deze gevoeligheid hangt samen met een aantal factoren zoals leeftijd, leverfunctie, genetische variatie bij microsomale enzymen en glutathione transferases, mogelijk medicijn/medicijn interacties en dieet.

Leeftijd
Kinderen lijken extra gevoelig voor VOD van een leeftijd van 2 tot 14. dit is gebleken uit vergiftigingsgevallen op Jamaica, in Midden-Amerika, in Afghanistan en in Tadzjikistan. Volwassenen zijn minder bevattelijk,maar hebben een slechtere prognose. De prognose voor kinderen met een Paracetamolvergiftiging is ook beter dan die bij volwassenen en is zelden fataal bij prepuberale kinderen, en meestal volledig herstellen, terwijl kinderen boven de 12 reageren als volwassenen.⁶⁵

Genetische variatie
Individuele gevoeligheid voor PA-toxiditeit kan ook samenhangen met inter-individuele verschillen in hepatocyte activatie en detoxificatie van pyrrolen door Cytochrome P450 enzymen zoals is aangetoond met senecionine.²⁰

Leverfunctie en medicijn/medicijn interacties

Waar CYP3A4 levels worden geïnduceerd door een medicijn zal het de mate van pyrroolformatie hoger zijn. Bijvoorbeeld zullen orale contraceptieven die worden gemetaboliseerd door CYP3A4 minder effectief zijn als de vrouw in kwestie ook phenobarbitoon omdat het oestrogenen sneller metaboliseerd.⁶⁷ De 14-jarige jongen met VOD in Groot-Brittannië toegeschreven aan Symphytum betrof een jongen met de Ziekte van Crohn, hij nam ook prednisoloon en sulphasalazine.⁶⁸

Andere belangrijke medicijnen die worden gemetaboliseerd door CYP3A4 zijn cyclosporine (immunosuppressant), nifedipine (Adalat), erythromycine, terfenadine (Triludan) en ethinyloestradiol. Als een persoon een van deze medicijnen tot zich neemt dan gaan de PA’s met deze medicijnen de competitie aan met het medicijn voor metabolisatie op een vast aantal plaatsen in de hepacyte. Medicijn/medicijn interacties zijn hoogstwaarschijnlijk niet het probleem omdat competities vooral voor dergelijke plaatsen het gemiddelde van de van pyrroleformatie omlaag bracht. Er is een medicijn/medicijninteractie tussen terfenadine en ketoconazole. Terfenadine is cardiotoxisch wanneer ze ongemetaboliseerd blijven en moeten niet samen met ketoconazole gebruikt worden die CYP 3A4 onderdrukt en daarmee het terfenadine metabolisme.⁶⁹

Medicijnen die CYP3A4 onderdrukken zijn de systemische antifungalen ketoconazole en itraconazole, het orale contraceptief gestodene, chloramphenicol en cimetidine. Sommige flavonoiden zoals in grapefruitsap en algemene cytochrome P-450's-remmers.⁷⁰

Glutathioon
Glutathioonstatus is erg belangrijk in medicijndetoxificatie. Als de glutathioonlevels worden afgebroken dan raakt de gereduceerde glutathione los van de cellen wat weer een nieuwe oorzaak is voor afbraak van cellevels. Glutathioonafbraak wordt als crucuaal beschouwd bij paracetamolvergiftiging. Met gebruikmaking van rattenweefsels is aangetoond dat glutathioonafbraak de pyrroolproteinverbindingen in de hepatocyt verhoogd. Het vierde geval van een PA-vergiftiging waarschijnlijk veroorzaakt door Smeerwortel was dat van een jonge man in Nieuw Zeeland⁷² VOD werd gediagnosticeerd uit een leverbiopsie wat de karakteristieke sinusoidale congestie en haemorrhagische centrilobulaire necrosis lieten zien. Er zijn echter wat twijfels over de doodsoorzaak door leverfalen omdat hij aanvankelijk leek te lijden aan influenza-achtige symptomen gevolgd door algehele malaise en nachtzweten. Hij at voornamelijk vegetarisch en at heel veel druiven en cashewnoten. Mogelijk leed hij ook aan een proteineondervoeding en was hij daardoor gevoelig voor zeer lage doseringen van PA’s.

Dieet
Glutathioonstatus hangt samen met het gehlate aan proteine in het dieet. Stuart en Bras⁷³ verklaren dat 'ondervoeding een belangrijke rol speelt zowel als onderdeel van de oorzaak en in de prognose’. Veel van de kinderen die werden behandeld tegen VOD hadden een voedingspatroon met veel carbohydraten en weinig proteine. De mensen die aan VOS leden in Afghanistan waren zwaar ondervoed.⁷⁴ Andere voedingsfactoren die een rol speken in de glutathioonstatus zijn de inname van selenium en van de inname van koolsoorten. Alcoholisten gaan sneller dood van een paracetamolvergiftiging in een lagere dosering door microsomale enzymeninductie, maar ook door slechte voeding.

Conclusies
Het moet duidelijk zijn uit dit artikel dat er veel dubbelzinnigheden zijn en ruimte voor verschillende interpretaties van de bevindingen. Toch kan men enkele conclusies trekken.

Men moet voorzichtig zijn met het gebruik van PA’s bevattende kruiden bij kinderen. er zijn echter gevallen waar het gebruik van Smeerwortelblad minder risico met zich meebrengt dan reguliere medicatie zoals bij colitis. Maar ze mogen niet worden gebruikt als het kind al prednisolone of andere cytochroom P450 verhogende middelen gebruikt.

Volwassenen die VOD krijgen hebben een aanmerkelijk slechtere prognose dan kinderen. wees voorzichtig met volwassenen die veel alcohol drinken, een geschiedenis van allergische of idiosyncratische reacties op medicijnen hebben, gebruik maken van orale contraceptieven, leverproblemen hebben en veel gebruik maken van medicijnen die CYP induceren.

Rifampicine wordt beschouwd als de sterkste CYP induceerder en men mag geen enkel kruid dat PA’s bevat geven aan mensen die ook dit middel gebruiken. Met ebtrekking tot Smeerwortel, S. officinale heeft veel lagere PA-concentraties dan S. x uplandicum, belangrijk is dat het fytotherapeutisch materiaal waarmee we werken afkomstig is van S. officinale. Het gebruik van S. tuberosum is het waard om onderzocht te worden vanwege het lage gehalte aan PA’s en het hoge gehalte aan allantoine.

Vrije verkoop van Smeerwortel maken het mogelijk om hoge doseringen in te nemen en waarschijnlijk hebben veel overheden het zekere voor het onzekere genomen door deze bereidingen van de schappen te verwijderen. Het zou echter mogelijk moeten zijn voor fytotherapeuten om Smeerwortel te kunnen voorschrijven in een gepaste dosering. Extracten van de wortel zitten ook lager in het gehalte aan PA’s dan de verpoederde wortel of bladeren. De bladeren zijn weer lager in PA-gehalte dan de wortels. Als men kijkt naar het gehalte van PA’s in tincturen en aftreksels kan door het gebruik van deze preparaten geen leverschade ontstaan en kan men deze veilig voorschrijven.

Als fytotherapeuten hebben we vaak te maken met het gebruik van fytotherapeutische middelen voor een langere duur en moeten we ieder geval apart bekijken omdat tegengestelde argumenten een rol spelen. Zelfs als er door het gebruik van Smeerwortelblad een opstapelend effect is van PA’s dan kan dit nog zo lang duren voordat dit een negatief effect heeft dat de patient mogelijk allang overleden vanwege ouderdom. Je kan dus wel degelijk denken aan langetermijngebruik bij oudere mensen als deze lijden aan artritis omdat het de afhankelijkheid van nonsteroidale ontstekingsremmende medicijnen verminderd die op zichzelf een veel sterfgevallen veroorzaken door perforatie van maag –e n darmzeren.

Net zo belangrijk is echter het strenge verbod in Duitsland van deze kruiden vanwege hun carcinogene effect, waarvan we geen idée hebben hoe zich dat op de lange termijn ontwikkeld.

Door een resumé van het huidige onderzoek naar planten die PA’s bevatten te geven hoop ik dat fytotherapeuten een weloverwogen beslissing kunnen nemen over het voorschrijven en toepassen van deze kruiden.

Alison Denham BA MNIMH

Vrije vertaling Gonnie van Elteren

Referenties

1. Whitelegg M. In Defence of Comfrey, European J Herbal Medicine 1994; 1: 11-17.
2. Mattocks AR. Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloids, Academic Press, 1986.
3. World Health Organization. Pyrrolizidine Alkaloids, Environmental Health Criteria, 80, WHO, Geneva, 1988.
4. Westendorf J .in Adverse Effects of Herbal Drugs I, Springer-Verlag, 1991.
5 . Roeder E. Medicinal Plants in Europe Containing Pyrrolizidine Alkaloids, Pharmazie. 1995; 50 H.2: 83-98.
6. Abbott PJ. Comfrey: Assessing the Low-Dose Health Risk, Med J Aust. 1988; 149: 678-682.
7. Bekanntmachung uber die Zulassung und Registrierung von Arzneimitteln, Bundesanzeiger. 1992; 17 June.
8. Winship KA. Toxicity of Comfrey, Adverse Drug Reactions. Toxicol. Rev. 1991;10[1]: 47-59.
9. Mattocks AR. op cit, Chapter 12, Relationships between Structure, Metabolism & Toxicity.
10. Yeong ML, et al. The Effects of Comfrey Derived Pyrrolozidine Alkaloids on Rat Liver, Pathology. 1991; 23: 35-38.
11 . Timbrell JA. Principles of Biochemical Toxicology, Taylor & Francis, 1991.
12. Mattocks AR. op cit: 131.
13. Seawright AA. Potential Toxicity Problems with Herbal Medicines and Food-New Observations with Pyrrolizidine alkaloids, Pro Nutr Soc Aust. 1992; 17: 20-25.
14. Mattocks AR, Bird I. Pyrrolic and N-Oxide Metabolites Formed from Pyrrolizidine Alkaloids by Hepatic Microsomes In Vitro: Relevance to In Vivo Hepatotoxicity, Chem-Biol Interactions. 1983; 43: 209-222.
15. Hincks JR, et al. DNA Cross-Linking in Mammalian Cells by Pyrrolizidine Alkaloids: Structure-Activity Relationships, Toxicol. Appl. Pharmacol. 1991; 111: 90-98.
16. Kim H-Y, Stermitz FR, Coulombe RA. Pyrrolizidine Alkaloid Induced DNA-Protein Cross-Links, Carcinogenesis. 1995; 16: 2691-2697.
17. Timbrell JA. op cit: 111-115.
18. González, Esteller A. Glutathione and Hepatobiliary Transport of Xenobiotics, in Viña J, ed, Glutathione: Metabolism and Physiological Functions,1990, CRC Press, USA.
19. Guengerich FP. Cytochromes P-450 of human liver, in ed Pacifici GM, Fracchia GN, Advances in Drug Metabolism in Man. 1995, European Commission: 179-233.
20. Miranda CL, et al. Role of Cytochrome P450IIIA4 in the Metabolism of the Pyrrolizidine Alkaloid Senecionine in Human Liver, Carcinogenesis. 1991; 12: 515-519.
21. Yeong ML, et al. Hepatocxyte Membrane Injury and Bleb Formation Following Low Dose Comfrey Toxicity in Rats, Int J Exp Path. 1993; 74: 211-217.
22. McDermott WV, Ridker PM. The Budd-Chiari Syndrome and Hepatic Veno-occlusive Disease, Arch Surg. 1990; 125: 525-527.
23. World Health Organization. op cit: 179-183
24. Tandon HD, Tandon BN. An Epidemic of Veno-Occlusive Disease of the Liver in Afghanistan, Am J Gastroenterology. 1978; 70: 607-613.
25 . Stuart KL, Bras G. Veno-Occlusive Disease of the Liver, Quarterly Journal of Medicine. 1957; 26: 291-315.
26 . Cheeke PR. Toxicity and Metabolism of Pyrrolizidine Alkaloids, J Anim Sci. 1988; 66: 2343-2350.
27. Blythe LL, Craig AM. Role of the Liver in Detoxification of Poisonous Plants, Vet Human Toxicol. 1994; 36 [6]: 564-565.
28. Cheeke, PR, op cit. 2346.
29. Chauvin P, et al. Lancet. June 26 1993; 341: 1663.
30. Mayer F, Luthy J. Lancet. July 24 1993; 342: 246-7.
31. Mohabbat O, et al. An Outbreak of Veno-Occlusive Disease in North-Western Afghanistan, Lancet. 1976; 2: 269-271.
32. Tandon HD, Tandom BN, op cit.
33. Schoental R. Health Hazards of Pyrrolizidine Alkaloids: A Short Review, Toxicology Letters. 1982; 10: 323-326.
34. Stuart KL, Bras G, op cit.
35. Frei H, et al. Structure/Activity Relationships of the Genotoxic Potencies of Sixteen Pyrrolizidine Alkaloids Assayed for the Induction of Somatic Mutation and Recombination in Wing Cells of Drosophila Melanogaster, Chem Biol Interactions. 1992; 83: 1-22.
36 . Statement by the Committee on Toxicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment,[COT] for MAFF, 1993.
37. Jaarsma TA, et al. Chemotaxonomy of the Symphytum officinale agg. [Boraginaceae], Pl Syst Evol. 1989; 167: 113-127.
38. Hills L. Comfrey, Past, Present & Future, Faber & Faber, 1976.
39. Stace C. New Flora of the British Isles, Cambridge University Press, 1991: 645-658.
40. Stelljes ME, et al. Chromatographic Techniques for the Identification of Pyrrolizidine Alkaloids, in James LF ed, Poisonous Plants, Iowa State University Press, 1992.
41. Chizzola R. Rapid Sample Preparation Technique for the Determination of Pyrrolizidine Alkaloids in Plant Extracts, J Chromatogr. 1994: A 668: 427-433.
42. Mossoba MM, et al. Application of Gas Chromatography/Matrix Isolation/Fourier Transform Infrared Spectroscopy to the Identification of Pyrrolizidine Alkaloids from Comfrey Root (Symphytum officinale L), Journal of AOAC International. 1994; 77: 1167-1174.
43. Pedersen E. Pyrrolizidine Alkaloids in Danish Species of the Family Boraginaceae, Arch. Pharm. Chemi Sci. Ed. 1975; 3: 55-64.
44. Culvenor CCJ, et al. The Alkaloids of Symphytum x uplandicum [Russian Comfrey], Aust J Chem. 1980; 33: 1105-1113.
45. Brauchli J, et al. Pyrrolizidine Alkaloids from Symphytum officinale L and their Percutaneous Absorption in Rats, Experientia. 1982; 38: 1085-1087.
46. Awang DVC, et al. Echimidine Content of Commercal Comfrey, Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants. 1993; 2: 21-34.
47. Mütterlein R, Arnold C-G, Untersuchungen zum Pyrrolizidinalkaloidgehalt und Pyrrolizidinalkaloidmuster in Symphytum oficinale L, Pharm Ztg Wiss. 1993; 138 No 5/6: 119-125.
48. Bhandari P, Gray, A. Pyrrolizidine Alkaloid N-Oxides from Symphytum tuberosum, J Pharmacy Pharmacol. 1985; 37 Supp: 50P.
49. Gray AI, et al, Hepatotoxic Alkaloids and Allantoin in Symphytum Tuberosum, J Pharm Pharmacol. 1983, 35 Supp: 13P.
50. Bone KM. Studies in Materia Medica, Part 1: Symphytum species, School of Herbal Medicine, Kent, 1984.
51. Statement by COT. op cit.
52. Betz JM. Determination of Pyrrolizidine Alkaloids in Commercial Comfrey Products, J Pharmaceutical Sciences. 1994; 83: 649-653.
53. Mattocks AR. op cit: 321.
54. Castell JV, et al. Glutathione Levels in Human Hepatocytes Exposed to Paracetamol, in Viña J, ed, op cit.
55. Berkow R, et al. Merck Manual, 16th Edition, 1992: 908.
56. British National Formulary, March 1996. Maximum Recommended Dose for an adult is 4g daily.
57. Modern Practice Monographs. The Herbal Practitioner, 1942; 3: 7-9.
58. WHO, op cit: 206.
59. Mattocks AR, op cit: 269.
60. Bach N, et al. Comfrey Herb Tea-Induced Hepatic Veno-Occlusive Disease, Am J Medicine. 1989; 87: 97-99.
61. Ridker PM, et al. Hepatic Venocclusive Disease Associated with the Consumption of Pyrrolizidine-Containing Dietary Supplements, Gastroenterology. 1985; 88: 1050-4.
62. Huxtable RJ, Luthy J, Zweifel U. Toxicity of Comfrey-Pepsin Preparations, New England Journal of Medicine. 1986:1095.
63. Kim H-Y, et al. Structural Influences on Pyrrolizidine Alkaloid-Induced Cytopathology, Toxicology and Applied Pharmacology 1993; 122: 61-69.
64. Shubat PJ, Huxtable RJ. The Threshold for Toxicity of the Pyrrolizidine Alkaloid, Monocrotaline in James LF ed, Poisonous Plants, Iowa State University Press, 1992.
65. Berkow R, et al. Merck Manual 16th Edition, 1992: 2118.
66. Tucker GT. Science and Drug Therapy, The Pharmaceutical Journal. 1995: 255: 376-379.
67. British National Formulary, March 1996: 189.
68. Weston, CFM, et al, Veno-Occlusive Disease of the Liver Secondary to Ingestion of Comfrey, BMJ. 1987; 295: 183.
69. Boobis, AR. Prediction of Inhibitory Drug-Drug Interactions by Studies in vitro, in Pacifici GM, Fracchia GN, eds, Advances in Drug Metabolism in Man, 1995, EU.
70. Ubeda A,et al. Effects of Flavonoids on Cytochrome P-450 from Rat Liver Microsomes: Inhibition of Enzyme Activities and Protection against Peroxidative Damage, Phytotherapy Research. 1995; 9: 416-420.
71. Yan CC, Huxtable RJ, Relationship Between Glutathione Concentration and Metabolism of the Pyrrolizidine Alkaloid, Monocrotaline, in the Isolated, Perfused Liver, Toxicology and Applied Pharmacology. 1995; 130: 132-139.
72. Yeong ML, et al. Hepatic Veno-Occlusive Disease Associated with Comfrey Ingestion, J Gastroenterology and Hepatology. 1990; 5: 211-214.
73. Stuart KL, Bras G. op cit: 307.
74. Thimbrell JA. op cit: 161, 221.